unieruchomienie stawu kolanowego

Komórki Colo205 traktowano przez 48 godzin UO126 oceniano metodą Western blot dla wskazanych białek. Badane lizaty były takie same jak te badane na Figurze 1C, a bloty przedstawione dla ufosforylowanego ERK, całkowitego ERK i aktyny są identyczne, zawarte w celu umożliwienia bezpośredniego porównania między utratą fosforylacji ERK i zmianami w białkach apoptozy. Analizę Western blot poziomów Bax i Bak przeprowadzono stosując nowe lizaty z komórek traktowanych identycznie, przy takim samym obciążeniu wykazano przez sondowanie dla p-aktyny. (C) Komórki PC3 i Colo205 nie były traktowane lub były traktowane przez 18 godzin 20 .M UO126, zebrane i poddane lizie. Lizaty nie były leczone lub były leczone. fosfatazę, a migrację Bim oceniano metodą Western blotting. W zdrowych komórkach Colo205 BimEL pojawił się jako szerokie pasmo (strzałka). Leczenie za pomocą. fosfataza wytworzyła pojedynczą wstęgę o pozornej niższej masie cząsteczkowej podobnej do tej po traktowaniu UO126. (D) Kontrolne i nadeksprymujące Bcl-2. komórki Colo205 nie były traktowane lub były traktowane przez 6, 24 lub 48 godzin 20 .M UO126 i oceniano metodą Western blot. Dane są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. Hamowanie MEK powodowało defosforylację Bim w zmutowanych komórkach Colo205 B-RAF. Aktywacja Bima często wiąże się z jego defosforylacją, co powoduje zmniejszenie pozornej masy cząsteczkowej na podstawie analizy SDS-PAGE (16, 17). Taka zmiana w BimEL była widoczna po traktowaniu komórek Colo205 UO126 (Figura 2, A i B), a zmiana fosforylacji Bim była wspierana przez traktowanie fosfatazami lizatów komórkowych (Figura 2C). Natomiast podobna analiza komórek PC3 ujawniła bardzo niewielką różnicę w migracji BimEL po hamowaniu MEK. Stosując ufosforylowane przeciwciała swoiste wobec Bad, było oczywiste, że ani reszta 112, ani reszta 136 Bad nie uległy zasadniczo defosforylacji w komórkach Colo205 po hamowaniu MEK (Figura 2D). Dane te wskazują, że Bim był konstytutywnie fosforylowany w zmutowanych komórkach nowotworowych B-RAF i że hamowanie MEK powodowało jego specyficzną defosforylację. Bim był niezbędny do indukowanej przez MEK apoptozy i utraty klonogenności w zmutowanych komórkach nowotworowych B-RAF. Aby zbadać rolę Bim w indukowanym przez MEK hamowaniu komórek zmutowanych komórek B-RAF, wygenerowaliśmy subklony komórek Colo205, w których RNAi stabilnie represjonowało ekspresję Bim (Figura 3A i Suplementowa Figura 1A, materiał uzupełniający dostępny online z tym artykułem; : 10,1172 / JCI35437DS1). Te komórki Bim knockdown (KD) były chronione przed zabijaniem indukowanym przez UO126 (Figura 3B i Suplementowa Figura 1A), chociaż nie tak silnie jak nadeksprymujące Bcl-2, najprawdopodobniej z powodu niepełnego KD Bim (Figura 3A). Co ważne, komórki z nadekspresją Bim KD i Bcl-2a uległy defosforylacji ERK1 / 2 i zatrzymaniu cyklu komórkowego w odpowiedzi na leczenie UO126, co wskazuje, że nadal odpowiadają na hamowanie MEK (Figura 3A i dane nie przedstawione). Nadekspresja Bim KD i Bcl-2 miała podobny wpływ na odpowiedź na hamowanie MEK w komórkach czerniaka SkMel-28, niezależnej linii komórkowej guza nowotworowego B-RAF (Suplemental Fig. 1B). Traktowanie UO126 przez 24 godziny spowodowało około 10-krotne zmniejszenie tworzenia kolonii macierzystych komórek Colo205, które zostało zablokowane przez nadekspresję Bim KD i Bcl-2 (Figura 3C). Jednak po 48 godzinach leczenia UO126 tylko nadekspresja Bcl-2 zapewniała ochronę przed utratą klonogenności, ponownie najprawdopodobniej z powodu niepełnego KD Bim z długoterminowym hamowaniem MEK (Figura 3A). Łącznie, te wyniki pokazują, że Bim jest niezbędny do indukowanej przez MEK apoptozy i utraty klonogenności zmutowanych komórek nowotworowych B-RAF. Figura 3 Apoptoza indukowana przez hamowanie MEK zmutowanych komórek nowotworowych B-RAF może być hamowana przez nadekspresję Bim KD lub Bcl-2. (A) Top: Analiza Western blot dokumentuje poziomy ekspresji Bim i (3-aktyny (kontrola kontroli) w macierzystych i 2 niezależnych subklonach RNAi Bim KD komórek Colo205
[patrz też: zespół mielodysplastyczny, koński pasożyt, ziarniak pachwinowy ]