len odtłuszczony na odchudzanie

Linie komórkowe czerniaka zostały dostarczone przez G. Boyle (Queensland Institute of Medical Research, Brisbane, Queensland, Australia), P. Hersey (University of Newcastle, Newcastle, Nowa Południowa Walia, Australia) i J. Blaydes (University of Southampton, Southampton Wielka Brytania) i były utrzymywane w RPMI-1640 zawierającym HEPES i 10% dezaktywowaną termicznie FCS (JRH Biosciences), z pasażowaniem przez trypsynizację. QVD-OPH (MP Biomedicals) zastosowano w doświadczeniach w końcowym stężeniu 25 .M i dodano do komórek 30 min przed dodaniem inhibitorów MEK. Inhibitory UO126, PD98059 (oba z CST), SP6, LY294002 (Merck), ABT-737 (dostarczone przez J. Baell, WEHI) i PD0325901 wszystkie rozpuszczono w DMSO i stosowano we wskazanych stężeniach. Konstrukty ekspresyjne dla ludzkiego BLC-2 znakowanego FLAG (33), shRNA anty-Bim (34) i konstruktu shRNA z rozmazanymi kontrolami (12) zostały opisane wcześniej. Niezależne shRNA dla ludzkich shimów kontroli Bim i kontroli niejonowania były darami Wiktoriańskiego Centrum Funkcjonalnej Genomiki. Transfekcję Fugene (Roche) przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. Transfekowane komórki wybrano przy użyciu .g / ml puromycyny i sklonowano w pojedynczej komórce metodą ograniczonego rozcieńczenia. Białka znakowane FLAG zostały wykryte przez cytoplazmatyczne barwienie immunofluorescencyjne przeciwciałem anty-FLAG (M2, Sigma-Aldrich) i analizą cytometrii przepływowej w FACScan (BD). Western blotting. Próbki białka oddzielono za pomocą SDS-PAGE, a następnie przeniesiono na membrany PVDF (Hybond P; Amersham Biosciences). Membrany zablokowano 5% odtłuszczonym mlekiem w proszku w PBS z 0,1% Tween 20 (Sigma-Aldrich), a następnie sondowano przeciwciałami przeciw Bcl-w (13F9; Alexis), Bcl-xL (BD Biosciences), Bim (klon 3C5; Alexis lub poliklonalny Ab, Stressgen), Bad (Stressgen), ufosforylowany Bad (Ser112), ufosforylowany Bad (Ser136), Bax (N20; Santa Cruz Biotechnology Inc.), Bak (Sigma-Aldrich), pocięty kaspazy-3, fosforylowany ERK1 / 2 (Thr202 / Tyr204), całkowita ERK1 / 2, ufosforylowana Akt (193H12, Ser473), całkowita Akt (wszystkie z CST), Bax (Upstate), ludzka Bmf (Alexis), białko szoku cieplnego 70 (Hsp70, N6; dar R. Andersona, Peter MacCallum Cancer Center, Melbourne, Victoria, Australia), Mcl-1 (Dako), PARP (Alexis), Puma (NT, Pro-Sci), lub (3-aktyny (Sigma-Aldrich). Wykrywanie przeprowadzano sprzężonymi z HRP przeciwciałami drugorzędowymi i ECL (Amersham Biosciences). Immunoprecypitacja. W celu immunoprecypitacji lizaty komórkowe najpierw oczyszczono przez inkubację przez 2 godziny z białkiem G-sepharose (Amersham Biosciences), a następnie inkubowano przez 2 h z kulkami Sepharose anty-Bim (3C5) mAb sprzężonymi z mAb. Kulki następnie przemyto przed wymywaniem 0,1 M glicyną HCl (pH 2,7), a następnie zobojętniono i wrzenie w buforze obciążającym. Testy śmierci komórkowej. Śmierć komórek oceniano za pomocą cytometrii przepływowej po uwolnieniu komórek z naczynia hodowlanego przez trypsynizację, albo przez barwienie jodkiem propidyny i sprzężonym z FITC aneksynem V, albo przez pomiar procentu komórek, które uległy fragmentacji DNA (DNA sub-G1), jak szczegółowo wcześniej (35). Aby porównać transfektanty, wyrażono apoptozę jako procent kontroli, obliczoną jako (1 [100 (próbka)) / (kontrola 100 y). Ta ostatnia technika została również wykorzystana do oceny zmian w rozkładzie cyklu komórkowego. W celu oznaczenia przeżycia klonogennego komórki wysiano w ilości 2,0 x 105 komórek / ml i traktowano przez 24 lub 48 godzin 20. M UO126 (CST) w obecności lub nieobecności ABT-737 (1. M, o ile nie wskazano inaczej). Komórki następnie trypsynizowano i przemyto w celu usunięcia leków przed dodaniem świeżej pożywki i wysiania przy różnych gęstościach komórek (1. 2400 komórek / studzienkę z co najmniej 8 dołkami na gęstość komórek i traktowanie) w 96-studzienkowych płytkach (Nunc).
[hasła pokrewne: zielony jęczmień zastosowanie, olx włodawa, ziarnica zlosliwa ]